(2° pagina) (Torna alla 1° pagina..) biliari interlobulari. Nel contesto dei dotti di Hering, è presente un compartimento staminale di cellule progenitrici residenti.
Le cellule progenitrici epatiche sono residenti, bipotenti in grado di differenziarsi verso i due lineage epiteliali del fegato, gli epatociti e i colangiociti. In genere, le cellule progenitrici sono morfologicamente caratterizzate da un nucleo ovale e da scarso citoplasma povero di organuli. In un fegato normale, le loro ridotte dimensioni le rendono difficilmente distinguibili. In realtà, sono fenotipicamente caratterizzate da una serie di marcatori che le rendono individuabili e facilmente identificabili. In particolare, le cellule progenitrici esprimono numerosi marker in comune con i colangiociti maturi, con gli epatociti maturi, con gli epatoblasti e con le cellule ematopoietiche; inoltre, le HPCs (Hepatic Progenitor Cells) sono positive per marker neuroendocrini, quali NCAM e cromogranina A.
La differenziazione delle cellule progenitrici verso cellule mature è caratterizzata da importanti modificazioni fenotipiche. Infatti, il processo differenziativo che conduce alla formazione di epatociti maturi viene contraddistinto inizialmente dalla comparsa di epatociti intermedi, cellule con dimensioni e fenotipo intermedio tra le HPC e gli epatociti maturi e identificabili per la scomparsa di alcuni marcatori quali la CK19, NCAM; di contro, il differenziamento verso i colangiociti maturi determina la formazione di dotti biliari immaturi con lume non ben identificabile e il mantenimento di marker neuroendocrini che scompaiono con il completamento del processo differenziativo in colangiociti maturi.
Le cellule progenitrici epatiche hanno infatti enormi potenzialità proliferative, comportandosi come vere e proprie cellule staminali unipotenti; anche nel corso di numerose patologie epatiche, la capacità proliferativa delle cellule parenchimali mature è in grado di garantire la restitutio ad integrum dell’organo; è il caso, ad esempio, di ciò che succede in alcuni diffusi modelli sperimentali di danno epatocitario (epatectomia parziale) o colangiocitario (legatura delle vie biliari).
In numerose patologie umane il compartimento staminale residente viene attivato; è il caso, ad esempio, dell’epatite acuta massiva (o submassiva); in tale situazione, l’entità e la rapidità con cui si instaura il danno è tale che i soli epatociti non sono sufficienti a far fronte alla perdita parenchimale. Inoltre, anche in patologie croniche di lunga data, la capacità proliferativa delle cellule parenchimali viene meno e il compartimento staminale viene attivato.
L’attivazione del compartimento staminale residente è caratterizzata dalla comparsa dei duttuli reattivi, la cosiddetta reazione duttulare. I duttuli reattivi sono strutture duttulari anastomizzate caratterizzate da un lume non identificabile e da un decorso tortuoso; sono costituiti da cellule con fenotipo altamente variabile; nel loro contesto sono infatti presenti cellule in differenti stadi di maturazione, molte delle quali in proliferazione. È infatti possibile trovare cellule progenitrici indifferenziate (CK7, 19 e NCAM positive) oppure cellule commissionate verso ciascuna delle due linee mature. Pertanto, nella patologia umana, la reazione duttale sembra essere composta da cellule con fenotipo differente e in stati differenziativi diversi a seconda della patologia che ha prodotto il danno epatico.
Per tale motivo, il nostro interesse si è rivolto allo studio della composizione cellulare dei duttuli reattivi in relazione a differenti patologie epatiche e all’individuazione dei sistemi di segnali in grado di influenzare lo sviluppo e di guidare l’attivazione del compartimento staminale residente verso specifiche linee mature. A tale scopo abbiamo selezionato 3 tipologie di patologie epatiche quali l’epatite acuta massiva, la cirrosi cronica da HCV e la cirrosi biliare primitiva. In tal modo è possibile confrontare la reazione duttale in caso di danno epatocitario acuto vs cronico e in caso di danno epatocitario cronico vs danno colangiocitario cronico. Da frammenti epatici provenienti da pazienti con le suddette patologie tramite microdissezione laser della reazione duttulare è stato isolato materiale costituito dalla nicchia staminale attivata. Da tale materiale è stato possibile estrarre l’RNA, amplificarlo e valutare l’espressione genica; contemporaneamente sulle sezione dei medesimi fegati è stata valutata l’espressione proteica mediante immunoistochimica.
In particolare, la microdissezione laser permette di sezionare e di raccogliere in una Eppendorf una porzione di tessuto da un preparato istologico. Nel nostro lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo rapido di immunoistochimica per un marker specifico delle cellule staminali (ck7) e abbiamo così microdissecato duttuli reattivi CK7 positivi.
I risultati ottenuti hanno dimostrato che nelle diverse patologie epatiche la reazione duttulare è composta da cellule staminali con differenti caratteristiche fenotipiche che rendono l’attivazione del compartimento delle cellule progenitrici unica e peculiare a seconda del tipo di insulto. In particolare, in corso di epatite acuta submassiva, si verifica il più grande aumento del numero di cellule progenitrici, le quali presentano un tipico fenotipo indifferenziato; in tali condizioni, la nicchia delle cellule staminali esprime altamente proteine del pathway di WNT/beta-catenina, implicato nella proliferazione delle cellule staminali; in tal modo, in corso di epatite acuta massiva, le cellule progenitrici sembrano essere principalmente stimolate a proliferare piuttosto che a differenziarsi. Nella cirrosi da HCV, il numero delle cellule progenitrici è discretamente attivato; fenotipicamente la reazione duttulare è caratterizzata da cellule negative per NCAM, CD133 e CK19, indice di cellule in differenziamento verso la linea epatocitaria. In un danno epatocitario cronico come la cirrosi da HCV, il coinvolgimento del compartimento progenitore nella rigenerazione del tessuto epatico è modesto e tardivo ed è contestuale alla riduzione delle capacità proliferative epatocitarie. La nicchia staminale presenta una scarsa attivazione del sistema WNT/beta-catenina come attesa da cellule staminali che hanno intrapreso un processo differenziativo; inoltre, la scarsa presenza di elementi del pathway di Notch/Jag-1 sembra indicare che l’inattivazione di tale sistema sia implicato nel commissionamento verso la linea epatocitaria. Nella cirrosi biliare primitiva, si assiste a un massivo aumento del numero dei duttuli reattivi; tali duttili, seppure perlopiù negativi a CD133, mantengono diffusamente l’espressione di NCAM indicando che la reazione duttulare è costituita da una popolazione cellulare che ha iniziato un processo differenziativo che per la maggior parte rimane bloccato senza generare cellule differenziate terminalmente. La nicchia esprime altamente sia elementi di WNT che di Notch e ciò sembra indicare che la persistente attivazione del primo sia responsabile nel determinare una stimolazione proliferativa del compartimento cellulare e un commissionamento in senso colangiocitario. Per riassumere, tale dati forniscono numerose informazioni sulle modalità di attivazione del compartimento staminale residente in corso di patologia epatica e sui segnali intracellulari implicati nella scelta del destino differenziativo. In primo luogo, è importante sottolineare che la reazione duttulare non è sempre la stessa in ogni patologia epatica, ma è quantitativamente e (soprattutto) qualitativamente differente in relazione al tipo e all’entità del processo patologico. Inoltre, CD133 sembra individuare una sottopopolazione di HPC completamente indifferenziate mentre NCAM sembra essere un marker di una popolazione di cellule già commissionate verso la linea colangiocitaria. Inoltre, i sistemi di WNT e Notch sembrano essere implicati: il primo nel mantenere le cellule in uno stato proliferativo piuttosto che differenziativo, mentre il secondo nell’indirizzare il differenziamento. Le informazioni sulla nicchia delle cellule progenitrici dei dotti biliari intra-epatici pone le basi per lo sviluppo di strategie di isolamento e di coltura di tali cellule. Un efficacie isolamento di cellule progenitrici epatiche da fegato adulto umano rappresenta una prima strategia per ottenere cellule da utilizzare in medicina rigenerativa. Negli anni passati alcuni gruppi di ricerca hanno isolato cellule progenitrici utilizzando Epcam e Thy-1 come marker per selezionare la popolazione staminale. Tuttavia, tali marker non riconoscono cellule progenitrici indifferenziate, ma popolazioni più ampie comprendendo anche cellule mature; inoltre, la mancanza sul mercato di prodotti clinical grade specifici ne limita l’utilizzo a scopi terapeutici a causa della legislazione europea in materia di trapianto di cellule staminali. Per tali motivazioni, il nostro interesse si è rivolto all’utilizzo di CD133 come marker per la selezione di cellule staminali epatiche da fegato umano adulto. La scelta di CD133 ha alcuni vantaggi; in primo luogo, come abbiamo visto, marca solamente cellule indifferenziate e, in secondo luogo, è stato ampiamente utilizzato nella pratica clinica per la selezione di cellule staminali ematopoietiche in ematologia. In tale contesto, abbiamo messo a punto un protocollo di isolamento che prevedeva l’utilizzo di fegati marginali di donatori che sono risultati, dopo valutazione istopatologia, non idonei per il trapianto. Brevemente, la procedura di isolamento è stata effettuata non sul fegato in toto, ma su frammenti delle dimensioni massime di 10 x 5 CE1. Tale scelta è stata necessaria per ridurre il consumo di costosi reagenti clinical grade nelle prime fasi sperimentali. Per prima cosa, sono stati incannulati rami della vena porta e dell’arteria epatica al fine di perfondere i frammenti di fegato, di “risciacquarli” dal sangue e di infondere enzimi per una prima digestione enzimatica; attraverso cell scraper, è stato isolato l’albero biliare intra-epatico, il quale è stato successivamente ridotto in minuti frammenti; la successiva digestione enzimatica di tali frammenti e il passaggio in filtri con pori di diametro decrescente ha permesso di ottenere una sospensione cellulare; tale sospensione cellulare è stata incubata con un anticorpo per CD133 coniugato con biglie magnetiche e, infine, le cellule CD133 positive sono state isolate mediante una separazione magnetica. Le cellule così isolate sono state osservate per valutarne la quantità e la vitalità e sono state caratterizzate immunofenotipicamente. In media, è stato possibile isolare circa 230.000 cellule con una vitalità maggiore del 70%. Attraverso tale procedimento, siamo riusciti a ottenere cellule staminali epatiche da fegato umano normale con fenotipo indifferenziato e con una metodologia applicabile in modalità GMP, necessaria per ottenere l’autorizzazione all’utilizzo di terapie cellulari come da indicazione della legislazione europea in materia. Tuttavia, tale procedura presenta importanti limitazioni legate al ridotto numero di cellule ottenibili dal fegato marginale e alla quantità esigua di fegati marginali non utilizzabili per il trapianto che pervengono. Queste sono state le motivazioni che ci hanno condotto a ricercare ulteriori strategie per isolare cellule staminali epatiche. In particolare, il nostro interesse si è rivolto al fegato fetale. In primo luogo, numerosi sono gli aborti terapeutici effettuati tra la 18a e la 22a settimana di gestazione a causa di malformazioni varie o alterazioni cromosomiche (trisomia 21); inoltre, a tale età, il fegato è una fonte ottimale di cellule staminali poiché è principalmente costituito da epatoblasti, cellule con bipotenzialità differenziativa, e da cellule della piastra duttale che, nel corso dello sviluppo, andranno a formare i dotti biliari intra-epatici e nel fegato adulto residuano come cellule progenitrici nei canali di Hering. Al fine di dimostrare la bipotenzialità delle cellule isolate, al mezzo di coltura standard sono stati aggiunti diversi schemi di trattamento che potessero indurre un differenziamento specifico verso un determinato lineage. Tra gli schemi di trattamento, l’aggiunta di Oncostatina M è risultata la più efficace nell’indurre il differenziamento in epatociti maturi mentre, parallelamente, la somministrazione di TUDCA ha indotto un diffuso differenziamento verso la linea colangiocitaria con la formazione di strutture simil-duttali in colture bidimensionali. Un ulteriore reservoir di cellule staminali potenzialmente utile per lo sviluppo di procedure di isolamento è rappresentato dall’albero biliare extraepatico, sul quale abbiamo recentemente focalizzato le nostre ricerche. L’ipotesi di partenza è stata che l’albero biliare extraepatico potesse contenere cellule staminali multipotenti di origine endodermica. Tale ipotesi nasce dalla conoscenza e dallo studio dello sviluppo embrionario dell’albero biliare. Infatti, nel corso dello sviluppo fetale, da un gruppo comune di cellule endodermiche nel contesto del duodeno hanno origine gli abbozzi del fegato, delle vie biliari extraepatiche e del pancreas ventrale. In particolare, sembra che dalle cellule multipotenti endodermiche abbiano origine un precursore epatico, l’epatoblasta, e un progenitore pancreatico-biliare; dagli epatoblasti derivano gli epatociti e le vie biliari intra-epatiche, mentre dal precursore pancreatico-biliare, il pancreas e le vie biliari extra-epatiche. Pertanto, nelle vie biliari extra-epatiche, cellule multipotenti endodermiche potrebbero essere residuate nella vita post-natale. In tal senso, il primo passo è stato la ricerca della nicchia di tali cellule staminali che è stata individuata nel contesto delle ghiandole peribiliari, disposte nel contesto della parete delle vie biliari. In particolare, tali ghiandole sono principalmente localizzate nel dotto epatico comune a livello dell’ilo epatico, nel dotto cistico e, in maggior numero, nella papilla epato. La caratterizzazione immunofenotipica di tali ghiandole ha permesso di identificare nel loro contesto cellule positive a numerosi marker di superficie, marker citoscheletrici e a fattori di trascrizione che sono altamente suggestivi di cellule staminali multipotenti. Inoltre, nel contesto delle medesime ghiandole, sono presenti cellule positive a marker di cellule mature, quali insulina e albumina. Le osservazioni immunofenotipiche sono ulteriormente confermate dall’espressione genica analizzata con rt-PCR. Il passo successivo è stato l’isolamento di tali cellule dalle vie biliari extra-epatiche. Tale isolamento è stato effettuato con successo sia attraverso metodiche di immunoselezione magnetica, sia mediante un protocollo simile all’isolamento da fegato fetale. Per testare la multipotenzialità di tali cellule sono stati sviluppati specifici terreni di coltura in grado di indurre il differenziamento in senso epatocitario, colangiocitario e pancreatico. L’analisi al microscopio elettronico a trasmissione permette di avere un’ulteriore conferma del differenziamento, per la presenza di tipici canalicoli biliari tra due cellule con giunzioni cellulari e corti microvilli. Se al mezzo di coltura standard viene aggiunto 60% collagene tipo I, VEGF, HGF, idrocortisone è possibile assistere allo sviluppo di colangiociti maturi. In colture 3D, tali cellule danno vita a una struttura arboriforme costituita da cellule con fenotipo di colangiociti maturi, come indicato dall’espressione di SR e CFTR. Infine, una differenziazione in senso di cellule beta-pancreatiche può essere indotta attraverso la somministrazione in coltura di 60% collagene tipo IV/laminina, B27, acido ascorbico, ciclopamide, acido retinoico, exendin-4. In tali condizioni, strutture simil-insulari emergono alla periferia delle colonie e sono in grado di produrre peptide c e insulina. Inoltre, test di stimolazione hanno confermato la capacità di tali colture di produrre peptide c. Infine, risultati preliminari su modelli sperimentali murini sembrano indicare la capacità di tali cellule, una volta iniettate, di correggere in vivo il diabete sperimentalmente indotto.
Questi risultati aprono importanti prospettive per l’utilizzo di tali cellule per la medicina rigenerativa, non solo epatica ma anche pancreatica. In conclusione, un compartimento di cellule staminali bipotenti epatiche è presente nell’albero biliare intra-epatico del fegato adulto e fetale. L’isolamento di tali cellule dal fegato adulto è possibile attraverso immuno-selezione per CD133, ma ha ridotte prospettive in ambito di medicina rigenerativa per la scarsa “resa” e la ridotta disponibilità di materiali. Tali cellule rappresentano però un bersaglio ideale per lo sviluppo di terapie farmacologiche tese a modularne i processi proliferativi/differenziativi. L’isolamento di cellule bipotenti da fegato fetale sembra possedere ottime prospettive per l’utilizzo in medicina rigenerativa epatica grazie alla numerosità delle cellule staminali che popolano il fegato fetale e alla ridotta manipolazione a vengono sottoposte per il loro isolamento. Infine, l’albero biliare extra-epatico contiene, nel contesto delle ghiandole peribiliari, una nicchia di cellule staminali multipotenti di origine endodermica. Tali cellule possono essere isolate e hanno la capacità di differenziarsi almeno in epatociti, colangiociti e cellule beta-pancreatiche mature. Per la relativa facilità di reperire il materiale da cui isolare tali cellule e la scarsa manipolazione, queste potrebbero rappresentare un candidato ideale per la medicina rigenerativa di fegato, vie biliari e pancreas.
Università degli studi di Roma "La Sapienza"
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16/11/2010 Prof. Eugenio Gaudio

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